La tinción de Gram es un procedimiento de tinción diferencial que muestra qué bacterias son Gram-positivas o Gram-negativas según el color de la tinción. El alcohol de acetona es un reactivo utilizado en este proceso para proporcionar la diferenciación de color. Las bacterias grampositivas tienen una capa gruesa de peptidoglicano y se tiñen de color púrpura, mientras que los microorganismos gramnegativos tienen poca o ninguna capa de peptidoglicano y se tiñen de rosa.

Una vez que se prepara un portaobjetos de muestra bacteriana, primero se usa cristal violeta para teñir la muestra. En este punto, tanto las bacterias grampositivas como las gramnegativas aparecerán de color púrpura. Por lo general, el cristal violeta se aplica en el portaobjetos durante 30 segundos antes de lavar cualquier exceso de tinte con agua. El cristal violeta puede adherirse un poco a las capas de peptidoglicano, por lo que no se eliminará toda la mancha primaria con el agua.

Luego se agrega yodo a la muestra durante un minuto. Actúa como mordiente, que sirve para fijar tintes en un proceso de tinción. El yodo realiza esta función uniéndose al cristal violeta y creando un complejo insoluble que se adhiere mucho mejor a la gruesa capa de peptidoglicano que se encuentra en las células bacterianas Gram-positivas que el cristal violeta solo. No hay un paso de lavado con agua después de agregar el yodo.

Se puede usar acetona o alcohol etílico como agente decolorante. El alcohol disuelve los lípidos que se encuentran en la membrana celular externa de las bacterias Gram-negativas, lo que permite que el complejo cristal violeta-yodo se filtre fuera de la capa más delgada de peptidoglicano. Se agrega el alcohol durante 10 a 20 segundos; se vierte en el portaobjetos hasta que se elimina todo el yodo y el escurrimiento es incoloro. En este punto del proceso de tinción de Gram, las bacterias Gram negativas son incoloras, mientras que las bacterias Gram positivas aún retienen el cristal violeta. Una vez terminado, el portaobjetos debe enjuagarse con agua para detener el efecto decolorante.

Luego se agrega safranina para aumentar la visibilidad y el contraste con las bacterias Gram-negativas incoloras. La mancha hace que estas bacterias se vean rosadas bajo el microscopio. Dado que la tinción se agrega a toda la muestra, también tiñe las bacterias Gram-positivas, pero el cristal violeta más oscuro oculta el color rosa safranina más claro. Una vez que la muestra del portaobjetos se ha inundado con safranina durante aproximadamente un minuto, se usa agua para lavar cualquier exceso de colorante que no se haya adherido a las células bacterianas.